Ayasofya Müzesi, Fatih Mahallesinde manastır olarak kurulmuştur. Trabzon'daki Komnenos Devleti Krallarından I. Manuel zamanında 1250-1260 yıllarında yapılmıştır. Ana kilise, şapeller, maşatlık ve diğer manastır birimleri yanı sıra kilisenin 25 metre batısındaki Çan Kulesi 1427 yılında yapılmıştır. Yunan Haçı planı ve düzgün kesme taş işçiliği ile inşa edilen manastırın kuzeydoğu Anadolu ve Van Havzası yapıları ile benzeşen cepheleri dikkat çekicidir. Ayrıca yapının iç mekânı, yoğun olarak fresk süsleme programı göstermektedir. 1648’de Trabzon’a gelen Evliya Çelebi'ye göre 1583 yılında Fatih Sultan Mehmet'in emriyle Kurd Ali Bey adında bir ayân tarafından bir minber ve müezzin mahfili eklenerek camiye dönüştürülmüştür. Günümüzde müze işlevi ile ziyarete açıktır.

Trabzon kent merkezinde, Fatih Mahallesi sınırları içerisinde, kayalık bir burun üzerinde, Erken Bizans Dönemine tarihlenen eski bir bazilikanın yerine inşa edilmiş olan Ayasofya, zamanla denize dolgu yapılması ve 2006 yılında devlet sahil yolunun deniz dolgusu yapılarak inşa edilmesi sonucu günümüzde denizden yaklaşık yarım kilometre içeridedir. Manastır düzeninde inşa edilen Ayasofya, “Kutsal Bilgelik” anlamına gelen ismi ile İstanbul’daki mabede öykünme olarak yapılmış olmalıdır. 

Ayasofya'nın Komnenos Kralı I. Manuel zamanında 1250-1260 arasında yapıldığı kabul edilir. Bazı kaynaklara göre ise 1204 öncesinde yapılmış, I. Manuel döneminde yenilenmiş bir yapı olarak değerlendirilirse de bu durum güncel mimari özelliklerle desteklenmemektedir. Yapı, Fatih Sultan Mehmet'in 1461 yılında Trabzon'u fethinden sonra da bir süre kilise olarak kullanılmaya devam etmiştir. Trabzon hakkındaki yayınlarda Ayasofya’nın cami oluşu için farklı tarihler verilmektedir. 1648’de Trabzon’a gelen Evliya Çelebi'ye göre 1583 yılında sultanın emriyle Kurd Ali Bey adında bir ayân tarafından bir minber ve müezzin mahfili eklenerek camiye dönüştürülmüştür. Ayasofya’yı cami halinde gören ilk batılı seyyah, 1609’da Trabzon’dan geçen Fransız Julien Bordier'dir. Julian Bordier camiye dönüştürülen yapının onarılmadığı için boş tutulduğunu ve ibadet için kullanıldığını bildirmiştir. Kimi araştırmalara göre ise Osmanlı Sultanı III. Murat zamanında Trabzon Beylerbeyi Ali Bey’in girişimleriyle 1670 tarihinde camiye çevrilmiştir. Uzun süre ibadete kapalı olan yapı, 1864’te Bursalı Rıza Efendi'nin teşvikleriyle onarılmıştır. Müslüman cemaatin topladığı 95.000 kuruş ile yerli ustalar tarafından onarılarak yeniden ibadete açılmıştır. Ancak kentin dışında olması dolayısıyla, sürekli kullanılmayan cami, Osmanlı Döneminde son olarak 1880’lerde onarılmıştır. I. Dünya Savaşı sırasında Trabzon’u işgal eden Rus ordusu tarafından depo ve askeri hastane olarak kullanılmıştır. Savaş sonrasında 1960 yılına kadar cami olarak kullanılmaya devam etmiştir. İngiliz arkeolog ve sanat tarihçisi David Talbot Rice, Ayasofya’daki freskleri açığa çıkarmak için bir proje başlatılmıştır. 1957-1962 yılları arasında Edinburgh Üniversitesi’nden Russell Vakfı uzmanları tarafından yürütülen çalışmalarla Ayasofya’nın iç yüzeylerini örten 19. yüzyıl sıvaları kaldırılarak altındaki freskler gün ışığına çıkarılmıştır. Bizans sanatıyla ilgili çevrede heyecan uyandıran bu çalışmanın ardından yapı, Vakıflar Genel Müdürlüğü tarafından restore edilmiş ve evrensel değer taşıyan fresklerin sergilenebilmesi için Ayasofya, müzeye dönüştürülmüştür. 2000'li yıllarda müzenin camiye dönüştürülmesi gündeme gelmiş ve Ayasofya'nın müze işlevi iptal edilerek 3 Haziran 2013 tarihinde Kültür Bakanlığı tarafından Vakıflar Genel Müdürlüğüne teslim edilmiştir. Ardından mahkeme kararları ve vakıf kaydındaki durumu göz önüne alınarak 28 Haziran 2013 Cuma günü kısmen cami olarak ibadete açılmıştır.

Manastır düzenindeki manzumenin başyapıtı durumundaki mevcut kilise, günümüze ulaşsa da manastırın diğer yapıları kaybolmuştur. Kaybolan bu yapılardan iki şapel temelleri sondaj kazıları ile ortaya çıkarılmıştır. 

Yapı, geç Bizans Kiliselerinin en güzel örneklerinden biri olarak kabul edilir. Kapalı kollu haç planlıdır, yüksek kasnaklı bir kubbeye sahiptir. Kuzey, batı ve güneyinde revaklı üç kirişi bulunmaktadır. Yapı ana kubbenin üzerine değişik tonozlarla örtülmüş ve çatıya farklı yükseltiler verilerek kiremitle örtülmüştür. Trabzon Krallığını yöneten Komnenosların karmaşık politik ilişkilerinden dolayı, mimarisi ve süslemeleri farklı medeniyetlerin mimari geleneğinden de izler taşımaktadır. Gerek Bagratlıların Doğu Karadeniz ve Van Havzasında inşa ettikleri Gürcü mimarisi etkili yapılarını ve gerekse Selçuklu mimari unsurları, yapı üzerinde görülebilmektedir.  Üstün bir işçiliğin görüldüğü taş plastiklerde Hristiyan sanatının yanı sıra Selçuklu Dönemi İslam sanatının da etkileri görülür. Kuzey ve batıdaki revak cephelerinde görülen geometrik geçmeli bezemeleri içeren madalyonlarla, batı cephesinde görülen mukarnaslı nişler Selçuklu taş işlemelerindeki özellikleri taşımaktadır. 

Binanın en görkemli cephesi güneyidir. Burada Adem'le Havva'nın yaratılışı kabartma olarak bir friz hâlinde anlatılmıştır. Güney cephesindeki kemerin kilit taşı üzerinde Trabzon'da 257 yıl hüküm süren Komnenos Hanedanı'nın sembolü olan tek başlı kartal motifi bulunmaktadır.

Yapının içindeki fresklerin 1260'a doğru tamamlandığı düşünülür. Fresklerde, İncil’den alınma konulara yer verilmiştir. Kilisenin batı yöne bakan narteksinin duvar ve tonoz örtüsü, boşluk kalamayacak şekilde Hristiyanlığın 12 Bayram anlatısını içeren sıcak renkli fresklerle kaplanmıştır. Naosu örten kubbe’de Pantokrator İsa, onun altında melekler korosu ve yazı kuşağı; kuşağın altında dizi halinde meleklerin yer aldığı bir friz, vardır; pencere aralarında oniki aziz tasvirleri yer alır. Kubbedeki ana tasvir İsa, onun tanrısal yönünü aksettiren Hristos Pantokrator (Her şeye kâdir İsa) tarzıdır. Bunun altında bir kitabe kuşağı, daha altta ise melekler frizi bulunur. Pencere aralarında on iki havari tasvir edilmiştir. Pandantiflerde değişik kompozisyonlar yer almaktadır. İsa'nın doğumu, vaftizi, çarmıha gerilişi, kıyamet günü gibi sahneler betimlenmiştir. Apsis tonozunun ortasında anelipsis sahnesi görülmektedir. Pandantiflerde ise değişik görünümlere yer verilmiştir. Mabedin batı tarafındaki dört köşe planlı ve iç duvarlarında resimler bulunan çan kulesi, kiliseden ayrı olarak 1427'de inşa edilmiştir. Çan kulesinin içindeki süslemeler 1443'te yapılmıştır. Yapıdan 25 metre ileride yer alan bu kule aynı zamanda yıldızları gözlemek, astronomi dersleri vermek amacıyla da kullanılmıştır. Kulenin ayrıca deniz feneri olarak da kullanılmış olabileceği düşünülür.